Возможность применения клеток костного мозга для аутологичной трансплантации в позднем периоде травматической болезни спинного мозга
Введение. Исследования последних лет показали способность стволовых клеток костного мозга дифференцироваться в нейрональном направлении in vivo и in vitro (Mezey E et al., 2000; Chopp M. Et all., 2000). Некоторыми авторами отмечены изменения дифференцировочного потенциала стволовых кроветворных клеток и функции лимфоцитов у больных со спинальной травмой (Kliesch WF, et all., 1996; Iversen PO. Et al., 2000). Поэтому вопрос о функциональной полноценности стволовых клеток и гемопоэтических предшественников в условиях нарушения нервной регуляции представляет интерес в плане возможности использования аутологичного костного мозга при проведении клеточной заместительной терапии у больных спинальной травмой.
Цель исследования
Изучение характеристик клеток костного мозга и возможности генерации мезенхимальных стволовых клеток у больных со спинальной травмой в позднем ее периоде.
Методика исследования
В исследование было включено 16 пациентов, находившихся на обследовании и лечении по поводу травматической болезни спинного мозга на базе нейрохирургического отделения НИИТО в период с 2004 г. по 2005 г. Группа больных была представлена 12 мужчинами и 4 женщинами в возрасте от 18 до 56 лет (средний возраст 28 ± 2,9 лет) с длительностью заболевания от 8 месяцев до 5 лет (в среднем 26 месяцев). С повреждением шейного отдела спинного мозга — 9 пациентов, грудного отдела позвоночника-7 больных. Аспират костного мозга получали с помощью процедуры трепанобиопсии крыла подвздошной кости. Фракцию мононуклеарных клеток (МНК) получали стандартно путем центрифугирования клеток аспирата в градиенте плотности фиколла-верографина. С целью характеристики выделенных клеток определяли общее количество мононуклеарных клеток, относительное содержание среди них CD34+ и CD34+CD38- стволовых кроветворных клеток, а также различных субпопуляций лимфоцитов (CD3, -4, -8, -16, -20) методом проточной цитофлюориметрии (FACSCallibur, Becton Dickinson) с использованием соответствующих моноклональных антител. Оценка поверхностных маркеров проводили в культурах МСК после 1-2 пассажей. Панель исследуемых маркеров включала оценку линейных антигенов (CD3, CD20, CD16, CD14), маркеров стволовых кроветворных клеток (CD34), а также CD90 (Thy1) и CD73 (SH-3). Математическая обработка проводилась методами описательной, параметрической и непараметрической статистики на персональном компьютере с использованием программы «Statistica 5».
Результаты
При оценке стволовых клеток костного мозга у больных с травматической болезнью спинного мозга в позднем периоде было выявлено, что количество мононуклеарных клеток, выделенных из аспирата костного мозга, в целом по группе имело тенденцию к повышению, а у пациентов с грудным уровнем повреждения было достоверно увеличено. Относительное содержание С034+клеток у больных было сходным с таковым у здоровых доноров. У больных со спинальной травмой отмечается увеличение в костном мозге количества С034+клеток и увеличение среди них относительного содержания CD34+CD38- стволовых кроветворных клеток и увеличение доли пролиферирующих клеток.
В качестве дополнительной характеристики клеток костного мозга у всех больных была предпринята попытка получения мезенхимальных стволовых клеток путем культивирования фракции прилипших к пластику клеток в среде DMEM, дополненной 15% фетальной телячьей сыворотки. Рост фибробластоподобных мезенхимальных клеток наблюдался у 11 из 15 пациентов. Необходимый для конфлюентного слияния период времени (до нулевого пассажа) варьировал от 7 до 28 дней. Фенотипическая характеристика показала, что эти клетки не экспрессировали линейных маркеров Т-клеток (CD3), В-клеток (CD20), NK-клеток (CD16), СКК (CD34) и HLA-DR молекулы, однако в подавляющем большинстве несли на своей поверхности характерные для мезенхимальных стволовых клеток CD90 (Thy1 антиген) и CD73 (SH-3 и SH-4).
В целом полученные данные свидетельствуют о сохранном количестве стволовых кроветворных клеток и возможности генерации мезенхимальных стволовых клеток в позднем периоде травматической болезни спинного мозга. Выявленное увеличение количества стволовых кроветворных клеток, ассоциированное с некоторым усилением их пролиферативного потенциала, может быть связано с ослаблением негативного контроля со стороны нервной системы в результате нарушения иннервации спинного мозга после травмы. Кроме того, нельзя исключить и нарушение процессов миграции стволовых клеток из костного мозга на периферию.
По нашим данным аутологичный костный мозг пациентов со спинальной травмой представляется приемлемым источником кроветворных и мезенхимальных стволовых клеток, которые могут быть потенциально использованы для проведения заместительной клеточной терапии.