Ксенон – инертный газ, не подвергающийся биотрансформации, слабо растворимый в жидких средах организма, быстро элиминирующийся преимущественно через легкие [6].
Несмотря на то, что наркотические свойства ксенона (Xe) известны с 1946 года [20], а в анестезиологии первое применение зафиксировано в 1951 году [6], до сих пор механизмы его наркотического действия остаются неясными [4]. Вследствие биохимической инертности Xе не обладает острой и хронической токсичностью [18], тератогенностью и эмбриотоксичностью, не является аллергеном [23], не нарушает целостность структур мозга [34], что затрудняет расшифровку эффектов на клеточном и субклеточном уровнях.
Известно прямое блокирующее влияние газа на нервные клетки [29], реализующееся, по-видимому, через изменение биохимического состава клеточных мембран [30], так как Хе обладает высокой растворимостью в липидах [28].
В связи с этим изучение состояния и спектра липидов в мозговой ткани при воздействии ксенона in vitro и in vivo вызывало несомненный интерес.
Методика
Эксперименты проводились на 26 мышах-самцах линии BALB/c массой 18-20 г. В исследованиях in vivo по 10 животных подвергались воздействию кислород-воздушной (30:70) либо ксенон-кислородной смеси (70:30) в закрытом объеме в течение 45 мин. Анестезированных и интактных (n=6) мышей декапитировали, извлекали из черепной коробки мозг и помещали в инкубационную среду, содержащую 50 мМ трис-HCl буфера, 0,25 М сахарозного буфера при рН=7,4. В исследованиях in vitro из головного мозга интактных животных готовили срезы и продували кислород-воздушной (30:70) либо ксенон-кислородной смесью (70:30) в течение 45 мин. Непосредственно после воздействия, через 1 и 3 часа в гомогенатах и супернатантах срезов мозга определяли состав липидов и содержание малонового диальдегида (МДА).
Для определения спектра и количества (г/л) липидов методом тонкослойной хроматографии [7] 100 мг ткани мозга заливали 8 мл инкубационной среды, гомогенизировали, процеживали, фильтрат центрифугировали и удаляли надосадочную жидкость. К осадку добавляли 3-5 мл реактива Фолча и 40 мкл концентрированной соляной кислоты, встряхивали в течение 15 мин и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 мин. Собирали супернатант и добавляли 1/5 от его объема 50 мМ хлорида кальция. Центрифугировали как описано выше, верхнюю фазу удаляли, нижнюю выпаривали и сухой остаток разводили каплей реактива Фолча, наносили на хроматографическую пластинку.
Фракционирование фосфолипидов проводили в хроматографических камерах в смеси хлороформ-метанол-ледяная уксусная ксилота–вода (60:25:1:3), нейтральных липидов – в системе гексан-диэтиловый эфир-метанол-ледяная уксусная кислота (90:20:3:2). После высушивания пластин их окрашивали 10% раствором фосфорномолибденовой кислоты в этаноле путем разбрызгивания из пульверизатора с последующим прогреванием при 100оС в течение 5 мин. Количественную обработку хроматограмм осуществляли при помощи компьютерных приложений.
Определение концентрации (мкМ/чглипидов) МДА проводили в тесте с 0,8 % тиобарбитуровой кислотой по образованию окрашенного комплекса, содержащего 1 молекулу МДА и 2 молекулы кислоты с последующим колориметрированием при длине волны 532 нм [7].
Статистическую обработку результатов осуществляли согласно U-критерию Манна-Уитни. Статистически значимыми считали различия при P<0,05 [10].
Результаты и обсуждение
Воздействие на вещество головного мозга кислород-воздушной смесью как in vivo, так и in vitro (табл.1) приводило в динамике эксперимента к статистически значимому нарастанию в ткани уровня малонового диальдегида (МДА), продукта перекисного окисления липидов мембран, ускоряющего старение клеток, точно отражающего интенсивность процесса в изолированных системах [3]. Известно, что свет и повышение концентрации кислорода усиливают окисление фосфолипидов [8]. При этом уровень МДА увеличивался как в цитоплазматической мембране, так и внутри клетки, по-видимому, вследствие обусловленного стрессом интенсивного окисления и набухания липидных слоев клеточных органелл, прежде всего митохондрий [15].
Поскольку ткань мозга, особенно богатая фосфолипидами [8], культивировалась в обедненной культуральной среде без антиоксидантов и макроэргов, можно предполагать, что прогрессирование перекисного окисления липидов (ПОЛ) имеет в системе in vitro необратимый характер и закончится в конечном итоге гибелью клеток [37] путем апоптоза либо, что более вероятно для выбранных экспериментальных условий, посредством некроза [36].
Так. уменьшение (в 1,5-2,5 раза, Pu<0,05) содержания фосфатидилинозитола в динамике культивирования (табл.2) может быть связано с прямой и опосредованной через образование инозиттрифосфата активацией ферментов (фосфатидилинозитол-3-киназа, протеинкиназа С), участвующих при неблагоприятных условиях в реализации клеточной смерти [25]. О деградации мембран свидетельствовало также увеличение содержания лизофосфолипидов с постоянной скоростью около 0,24 г/л в час (рис.1). При этом в каждый последующий срок величины показателя статистически значимо превышали предыдущие значения (табл.2).
Лизофосфолипиды – метаболиты фосфолипидов, образующиеся при активации фосфолипаз, в больших концентрациях весьма токсичны для клеточных мембран [5,8]. В наших экспериментах субстратом образования лизофосфолипидов могли быть фосфатидилинозитол, в меньшей степени фосфатидилсерин(холин) и сфингомиелин (табл.2). В норме существует асимметрия расположения фракций липидов в наружном и внутреннем слоях клеточных мембран, имеющая важное значение для их функционирования. Фосфатидилхолин и сфингомиелин локализуются преимущественно в наружном липидном слое, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин и фосфатидилинозитол – во внутреннем.
Содержание холестерола увеличивается по направлению к наружной стороне цитоплазматической мембраны [1,8,12,19]. Поэтому зафиксированное падение уровней фосфолипидов в сочетании с высокой концентрацией МДА в ткани мозга могло быть маркером активного двустороннего окисления липидов мембран, преимущественно внутреннего слоя, вызывающего нарушения функций клетки в целом [2,14].
Известно, что при усилении ПОЛ клетка защищается увеличением синтеза и ресинтеза фракций липидов и холестерина, повышающих микровязкость мембран [11]. Однако концентрация холестерина в мембранах при продувании кислород-воздушной смеси статистически не менялась в динамике эксперимента (табл.2, рис.2), что при высоком уровне МДА может говорить об увеличении проницаемости мембран клеток [17], приводящему к их лизису в культуре [1]. По-видимому, использованные в работе экстремальные факторы превышали компенсаторные возможности клеток мозга.
Прямое воздействие ксенона на нервную ткань в системе in vitro вызывало снижение уровня МДА (табл.1). Протекторное действие инертного газа при исследовании гомогенатов мозговой ткани носило длительный характер с достижением статистических различий через 3 часа после воздействия. Вероятно, ксенон стабилизирует внутриклеточные процессы вследствие диполь-дипольного взаимодействия с молекулами свободной воды и образования конгломератов (микрокристаллов клатратного типа), приводящих к снижению ее подвижности.
На уровне нейрона, состоящего на 78 % из воды и на 12 % из липидов, это приводит к стабилизации мембран, сопровождающейся блокированием ионных каналов, снижением их электропроводности и возбудимости [4,6]. В то же время обусловленная ксеноном регуляция концентрации МДА в супернатантах срезов головного мозга имела неоднозначный характер (табл.1). На фоне значительного снижения уровня субстрата (точки 0 и 3 часа) через 2 часа после продувания инкубационной среды ксенон-кислородной смесью наблюдался овершут с двукратным увеличением показателя по сравнению с контролем (Pu<0,05).
Увеличение МДА в межклеточном пространстве является маркером окисления наружного липидного слоя и может быть связано как с нейронами, так и другими клетками, присутствующими в срезах головного мозга. По крайней мере, значительное количество МДА в инкубационной жидкости при ксеноновом наркозе in vivo (табл.1, точки 0 и 1 час), увеличивающем, по некоторым данным [27], мозговой кровоток, частично может быть обусловлено окислением мембран клеток крови.
Кратковременное и мощное повышение содержания МДА в инкубационной жидкости in vitro позволяет считать наиболее вероятной его причиной “респираторный взрыв” нейтрофилов, клеток системы мононуклеарных фагоцитов (моноцитов/макрофагов,микроглиальных клеток) [13], обусловленный кислородом и возникающий, по-видимому, в результате снятия блокирующего влияния ксенона после его естественного удаления из культуры. Это сопровождается продукцией свободных радикалов, перекисей и окиси азота в межклеточное пространство [24], стимулирующих перекисное разрушение мембран нервных и других типов клеток.
С другой стороны, сразу после воздействия ксенон-кислородной смеси in vivo (точка 0) отмечалось непродолжительное повышение (по сравнению с кислород-воздушной смесью) концентрации лизофосфолипидов в мембранах (на 135 %, Pu<0,05) и продукта ПОЛ в гомогенате тканей мозга (на 118 %, Pu<0,05) (табл.1,2). Хотя на уровне макроорганизма не выявлены побочные эффекты ксенона [18], на клеточном уровне, по-видимому, существует период последействия, связанный с его отменой и сопровождающийся кратковременным усилением свободнорадикальных процессов.
Так, некоторое падение содержания фосфатидилэтаноламина (табл.2) могло быть обусловлено активацией фосфолипазы D, обнаруженной в растворимой фракции и микросомах мозговых клеток и расщепляющей субстрат с отделением этаноламина [8] как источника оксида азота [39]. В системе in vivo отмена ксенона, являющегося антагонистом NMDA (N-methyl-D-aspartate) рецепторов [21], может реализоваться их сенситизацией к субстратам (глутамат, аспартат), гиперактивацией с увеличением концентрации внутриклеточного мессенджера (оксида азота, NO), запускающего ПОЛ самостоятельно и совместно с активными формами кислорода (через образование пероксинитрита ONOO-) [24, 26,35].
NMDA-рецепторы располагаются на мембране нейронов, микроглиальных клеток, нейтрофилов и моноцитов/макрофагов [24], поэтому ПОЛ будет протекать как внутри, так и снаружи липидного бислоя за счет прямых и опосредованных через микроокружение эффектов. В то же время кратковременность усиления ПОЛ после воздействия ксенона и кислорода, в отличие от кислород-воздушной смеси, говорит о способности мозговых клеток адаптироваться к экстремальным условиям. Через 3 часа после прямого и опосредованного воздействия ксенона на головной мозг уровни МДА либо достоверно снижены, либо не отличаются от контрольного уровня (табл.1), скорость прироста лизофосфолипидов составляет 40 % таковой в контроле (рис.1). При этом клетки после отмены ксенона адекватно реагировали на усиление ПОЛ повышением в липидном бислое содержания фосфатидилсерина(холина), фосфатидилэтаноламина и холестерина (рис.1,2), что сохраняет упорядоченность состава липидов, необходимую для рационального функционирования клеток, даже в обедненной культуральной среде.
Подобный “адаптогенный” эффект ксенона на клеточном уровне базируется, вероятно, на толерантной (гипобиотической) стратегии адаптации [9] к стрессу (голодание клеток+гипероксигенация), усиливающему процессы ПОЛ [15]. Это может лежать в основе выявленных у благородного газа радиопротекторных свойств [16], способности ограничивать инфаркт миокарда [31] и реакцию стресс со стороны других систем жизнеобеспечения человека [38].
Добавление антиоксидантов в профилактическом и терапевтическом режимах может нивелировать свободнорадикальные процессы, активирующиеся после отмены ксенона, и, таким образом, оптимизировать ксеноновую терапию и анестезию. Даже в том случае, если повышение уровня фосфатидилсерина, обусловленное ксеноном, реализуется на наружной стороне цитоплазматической мембраны, что является биохимическим маркером апоптоза [19,33], для тканей, находящихся в экстремальных условиях, данную форму гибели клеток можно считать позитивной по сравнению с некрозом, так как она не сопровождается интенсивным воспалением и генерализацией процесса [22,32].
Выводы:
1. Прямое действие ксенона на клетки мозговой ткани тормозит скорость ПОЛ в экстремальных условиях жизнедеятельности.
2. Отмена ксенон-кислородной смеси приводит к кратковременному усилению процессов ПОЛ. Обратимая деградация липидного бислоя мембран клеток мозга может реализоваться на внутриклеточном и внеклеточном уровнях посредством прямого воздействия кислорода, активации фосфолипаз и характеризуется, по-видимому, усилением продукции свободных радикалов через лиганд-рецепторные взаимодействия, клетки микроокружения и иммунного надзора.
3. Ксенон способствует адаптации клеток мозга к неблагоприятным условиям жизнедеятельности.
4. В целях предотвращения побочных эффектов ксеноновая терапия и анестезия требуют профилактического и терапевтического применения антиоксидантных фармакологических препаратов.
Благодарность
Исследования поддержаны Томским региональным некоммерческим фондом «Сибирь без наркотиков и болезней. Новые медицинские технологии.».
ЛИТЕРАТУРА
1. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж. и др. Молекулярная биология клетки: в 5-ти томах.Т.2.-М., 1986.
2. Болдырев А.А. Биологические мембраны и транспорт ионов.-М., 1985.
3. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах.-М., 1972.
4. Годин А.В., Титов В.А., Стамов В.И. и др. // Анестезиология и реаниматология.-1999.-№ 5.-С.56-59.
5. Грибанов Г.А. // Вопр.мед.химии.-1991.-№ 4.-С.2-10.
6. Дамир Е.А., Буров Н.Е., Макеев Г.Н., Джабаров Д.А. // Анестезиология и реаниматология.-1996.-№ 1.-С.71-75.
7. Камышников В.С. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике: В 2-х томах.-Минск, 2000.
8. Климов А.Н., Никульчева Н.Г. Обмен липидов и липопротеидов и его нарушения.-СПб,1999.
9. Кулинский В.И., Ольховский И.А. // Успехи современной биологии.-1992.- Т.112.-Вып.5-6.-С.697-713.
10. Лакин Г.Ф. Биометрия.-М., 1990.
11. Мажуль Л.М., Давидович К.К., Гулько В.В. // Вопр.мед.химии.-1990.-№ 4.-С.10-11.
12. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэл В. Биохимия человека: В 2-х томах.- М., 1993.
13. Маянский А.Н., Маянский Д.Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге.-Новосибирск, 1989.
14. Новицкий В.В., Степовая Е.А., Гольдберг В.Е. и др. Эритроциты и злокачественные новообразования.-Томск, 2000.
15. Панин Л.Е. Биохимические механизмы стресса.-Новосибирск, 1983.
16. Тестов Б.В., Ефимов В.В., Сурнин А.Г. // Третье рабочее совещание “Новые медицинские технологии”, 12-15 ноября 2000 г., Томск.- Москва, 2000.-С.35-39.
17. Bretscher M.S., Munro S. // Science.-1993.-Vol.261.-P.1280-1281.
18. Burov N.E., Makeev G.N., Potapov V.N. // Applied Cardiopulmonary Pathophysiology.-2000.-Vol.9.-P.132-133.
19. Fadok V.A., Bratton D.L., Frasch C. et al. // Cell Death and Differentiation.-1998.-Vol.5.-P.551-562.
20. Ferrari A., Erdmann W., Del Tacca M. et al. // Applied Cardiopulmonary Pathophysiology.-1998.-Vol.7.-P.153-155.
21. Goto T. Xenon anesthesia – results from human studies // Applied Cardiopulmonary Pathophysiology.-2000.-Vol.9.-P.129-131.
22. Haslett C. // British Medical Bulletin.-1997.-Vol.53.-P.669-683.
23. Joyce J.A. // AANA J.-2000.- Vol. 68.- N 3.-P.259-264.
24. Kobayashi H., Suzuki T., Saito S. et al. // Toxicology&Ecotoxicology News/Reviews.-1997.-Vol.4.-N.1.-P.15-19.
25. Lavin M.F., Watters D., Song Q. // Experientia.-1996.-Vol.52.-P.979-994.
26. Linn W.S., Wong K.Y. // FASEB Journal.-1995.-Vol.9.-P.1147-1156.
27. Marx T., Kotzerke J., Musati S. et al. // Applied Cardiopulmonary Pathophysiology.-2000.-Vol.9.-P.91-96.
28. Marx T., Wagner D., Baeder S. et al. // Applied Cardiopulmonary Pathophysiology.-1998.-Vol.7.-P.215-221.
29. Miyazaki Y., Adachi T., Utsumi J. et al. // Anesth Analg.-1999.-Vol.88.-P.893.
30. Natale G., Ferrari E., Pellegrini A. et al. // Applied Cardiopulmonary Pathophysiology.-1998.-Vol.7.-P.227-233.
31. Preckel B., Mullenheim J., Moloschavij A. et al. // Anesth Analg.-2000.-Vol. 91.-P.1327-1332.
32. Samali A., Gorman A.M., Cotter T.G. // Experientia.-1996.-Vol.52.-P.933-941.
33. Savill J. // British Medical Bulletin.-1997.-Vol.53.-P.491-508.
34. Schmidt M., Papp-Jambor C., Schirmer U. et al. // Applied Cardiopulmonary Pathophysiology.-2000.-Vol.9.-P.87-90.
35. Sies H., de Groot H. // Toxicology Letters.-1992.-Vol.64/65.-P.547-551.
36. Tan S., Wood M., Maher P. // J. of Neurochemistry.-1998.-Vol.71.-P.95-105.
37. Tong L., Toliver-Kinsky T., Taglialatela G. et al. // J. of Neurochemistry.-1998.-Vol.71.-P.447-459.
38. Vovk S., Lukinov A.V., Naoumov S.A. et al. // Applied Cardiopulmonary Pathophysiology.-2000.-Vol.9.-P.169.
39. Wink D.A., Cook J.A., Pacelli R. et al // Toxicology Letters.-1995.-Vol.82/83.-P.221-226.